如何革兰染色(附图)

目录:

如何革兰染色(附图)
如何革兰染色(附图)
Anonim

革兰氏染色是一种快速程序,用于寻找组织样本中是否存在细菌,并根据细菌细胞壁的化学和物理特性将细菌定性为革兰氏阳性或革兰氏阴性。革兰氏染色几乎总是作为诊断细菌感染的第一步进行的。

革兰氏染色以丹麦科学家 Hans Christian Gram (1853 – 1938) 的名字命名,他于 1882 年开发了该技术并于 1884 年将其作为一种区分具有相似临床症状的两种细菌的技术:肺炎链球菌(也称为肺炎链球菌)肺炎球菌)和肺炎克雷伯菌。

脚步

第 1 部分(共 3 部分):准备革兰氏染色

革兰氏染色步骤 1
革兰氏染色步骤 1

步骤 1. 准备实验室工作。

戴上手套,将长头发扎在脑后,以防止污染您要测试的细菌样本。在通风橱下或另一个通风良好的区域对工作区进行消毒。在开始之前检查本生灯和显微镜是否正常工作。

革兰氏染色步骤 2
革兰氏染色步骤 2

步骤 2. 对玻璃显微镜载玻片进行消毒。

如果载玻片脏了,请用肥皂水清洗以去除油脂和污垢。用乙醇、玻璃清洁剂或实验室推荐的任何方法对载玻片进行消毒。

革兰氏染色步骤 3
革兰氏染色步骤 3

步骤 3. 将样品添加到载玻片中。

您可以使用革兰氏染色法来帮助识别医学样本中存在的细菌,或培养皿中生长的细菌培养物。为了使革兰氏染色有用,添加一个 薄的 污渍上的样品层。建议使用 24 小时以下的样本,因为较老的细菌可能已损坏细胞壁,对革兰氏染色的反应较难预测。

  • 如果使用组织样本,在载玻片上滴加 1-2 滴。使用第二个经过消毒的载玻片的边缘将其均匀地涂抹在载玻片上以形成薄涂片。在继续之前让它风干。
  • 如果从培养皿中取出细菌,请在本生灯火焰中对接种环进行消毒,直到它发光,然后让它冷却。用它在载玻片上滴一滴无菌水,然后再次消毒和冷却环路,然后转移一小部分细菌样本并轻轻搅拌入水中。
  • 肉汤中的细菌应在涡旋器中混合,然后按上述方式加入接种环,无需添加额外的水。
  • 如果您有拭子样本,请在载玻片上轻轻滚动拭子。
革兰氏染色步骤 4
革兰氏染色步骤 4

步骤 4. 热修复涂抹。

热量会将细菌固定在载玻片上,因此它们在染色过程中不容易被冲洗掉。将载玻片快速通过本生灯火焰 2 到 3 次,或在电动载玻片加热器上加热。不要过热,否则样品可能会变形。如果使用本生灯,火焰应该是一个小的蓝色圆锥体,而不是一个高大的橙色圆锥体。

或者,涂片可以用甲醇固定,方法是在干燥的涂片上加入 1-2 滴甲醇,排出多余的甲醇,然后风干。这种方法最大限度地减少了对宿主细胞的损害,提供了一个更干净的背景。

革兰氏染色步骤 5
革兰氏染色步骤 5

步骤 5. 将载玻片放在染色托盘上。

染色托盘是一个浅金属、玻璃或塑料盘,顶部有一个小网或金属丝支撑。将载玻片放在此支架的顶部,这样您将使用的液体就可以流入托盘。

如果您没有染色托盘,可以将载玻片直接放在塑料冰块托盘的顶部。

第 2 部分(共 3 部分):执行革兰氏染色

革兰氏染色步骤 6
革兰氏染色步骤 6

步骤 1. 用结晶紫淹没涂片。

使用移液器将几滴结晶紫染料(有时称为龙胆紫)注入细菌样本。等待三十到六十秒。结晶紫 (CV) 在水溶液中分解为 CV+ 和氯 (Cl-) 离子。这些离子穿透革兰氏阳性细胞和革兰氏阴性细胞的细胞壁和细胞膜。 CV+ 离子与细菌细胞中带负电荷的成分相互作用,将细胞染成紫色。

许多实验室使用“哈克”结晶紫,其中添加了草酸铵以防止沉淀。

革兰氏染色步骤 7
革兰氏染色步骤 7

步骤 2. 轻轻冲洗掉结晶紫。

倾斜载玻片并使用洗瓶在载玻片顶部喷出一小股蒸馏水或自来水。水应该流过涂片的表面,但不要直接对准它。不要过度冲洗,这可能会去除革兰氏阳性菌的污渍。

革兰氏染色步骤 8
革兰氏染色步骤 8

步骤 3. 用碘浸渍涂片,然后冲洗。

用移液管用碘覆盖涂片。让它静置至少 60 秒,然后用同样的小心方法冲洗干净。碘以带负电荷的离子形式与 CV+ 相互作用,在细胞内层和外层内形成结晶紫和碘的大型复合物(CV-I 复合物)。这会将紫色结晶紫捕获在细胞中,无论它在哪里染色。

碘具有腐蚀性。避免吸入、摄入或皮肤接触。

革兰氏染色步骤 9
革兰氏染色步骤 9

步骤 4. 添加脱色剂,然后快速冲洗。

此关键步骤通常使用 1:1 的丙酮和乙醇混合物,必须仔细计时。以一定角度握住载玻片,然后添加脱色剂,直到排水径流中不再出现紫色。这通常需要不到 10 秒的时间,如果脱色剂含有更高浓度的丙酮,则时间甚至更短。立即停止,否则脱色剂将从革兰氏阳性细胞和阴性细胞中去除结晶紫染色,并且必须重复染色。立即使用较早的技术冲洗掉多余的脱色剂。

  • 可以使用纯 (95%+) 丙酮代替。丙酮越多,脱色剂的工作速度就越快,需要更精确的计时。
  • 如果您在此步骤的时间安排上遇到问题,请考虑逐滴添加脱色剂。
革兰氏染色步骤 10
革兰氏染色步骤 10

步骤 5. 用复染剂淹没涂片,然后冲洗。

复染剂,通常是番红或品红,用于通过将脱色(革兰氏阴性)细菌染成粉红色或红色,在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间增加额外的对比度。保持至少 45 秒,然后冲洗干净。

品红会更强烈地染色许多革兰氏阴性菌,例如嗜血杆菌属和军团菌属。这可能使它成为初学者的更好选择。

革兰氏染色步骤 11
革兰氏染色步骤 11

步骤 6. 干燥载玻片。

您可以让载玻片风干,或使用为此目的出售的吸水纸吸干。革兰氏染色完成。

第 3 部分(共 3 部分):检查结果

革兰氏染色步骤 12
革兰氏染色步骤 12

步骤 1. 准备光学显微镜。

将载玻片置于光学显微镜下。细菌的大小差异很大,因此所需的总放大倍数从 400 倍到 1000 倍不等。在这些放大倍数的较高端,建议使用油浸物镜以获得更高的清晰度。在载玻片上滴一滴浸油,避免在应用过程中移动以防止气泡。移动显微镜转台,使物镜卡入到位,接触油。

油浸只能用于专门设计的镜头,不能用于“干”镜头。

革兰氏染色步骤 13
革兰氏染色步骤 13

步骤 2. 识别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

在光学显微镜下检查载玻片。革兰氏阳性细菌呈紫色,这是由于结晶紫被困在其厚厚的细胞壁内。革兰氏阴性菌呈粉红色或红色,因为紫罗兰色穿过薄薄的细胞壁,然后粉红色的复染剂进入它们。

  • 如果样本太厚,您可能会看到假阳性结果。如果所有细菌类型均为革兰氏阳性,则对新样本进行染色,以确保结果正确。
  • 如果脱色器运行时间过长,您可能会看到假阴性结果。如果所有细菌类型均为革兰氏阴性,则对新样本进行染色,以仔细检查您的结果。
革兰氏染色步骤 14
革兰氏染色步骤 14

步骤 3. 查找参考图像。

如果您不确定细菌是什么,请查看一组参考图像,按革兰氏染色的形状和结果排序。您可以在国家微生物病原体数据库和许多其他网站上找到在线数据库。为了使识别更容易,常见或诊断上重要的例子按革兰氏状态和形状分类如下。

革兰氏染色步骤 15
革兰氏染色步骤 15

步骤 4. 通过形状识别革兰氏阳性菌。

细菌在显微镜下根据它们的形状进一步分类,最常见的是球菌(球形)或杆状(圆柱形)。以下是一些按形状组织的常见革兰氏阳性(紫色染色)细菌:

  • 革兰氏阳性球菌 通常是葡萄球菌(表示成簇的球菌)或链球菌(表示成链的球菌)。
  • 革兰氏阳性棒 包括芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、棒状杆菌和李斯特菌。放线菌属杆通常有分支或细丝。
革兰氏染色步骤 16
革兰氏染色步骤 16

步骤 5. 识别革兰氏阴性菌。

革兰氏阴性(粉红色染色)细菌通常分为三组。球菌是球形细菌,杆是细长的细菌,球状杆介于两者之间。

  • 革兰氏阴性球菌 最常见的是奈瑟菌属。
  • 革兰氏阴性棒 包括大肠杆菌、肠杆菌、克雷伯菌、柠檬酸杆菌、沙雷氏菌、变形杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌等。霍乱弧菌可表现为普通杆状或弯曲杆状。
  • 革兰氏阴性“球状”杆状体(或“球状杆菌”) 包括博德氏菌、布鲁氏菌、嗜血杆菌和巴氏杆菌。
革兰氏染色步骤 17
革兰氏染色步骤 17

步骤 6. 评估混合结果。

由于细胞壁的脆弱性或蜡质,某些细菌难以精确染色。它们可能在同一个细胞中或在同一涂片中的不同细胞中混合有紫色或粉红色染色。任何超过 24 小时的细菌样本都可能存在此问题,但有些物种在任何年龄都难以染色。他们可能需要更专业的测试来缩小识别范围,例如抗酸染色、培养物生长观察、TSI 培养基培养或基因检测。

  • 放线菌、节杆菌、棒状杆菌、分枝杆菌和丙酸杆菌属。都被认为是革兰氏阳性细菌,但经常出现不确定的染色。
  • 细长的细菌,如密螺旋体、衣原体和立克次体。很难正确进行革兰氏染色。
革兰氏染色步骤 18
革兰氏染色步骤 18

步骤 7. 处理材料。

废物处理程序因实验室和使用的材料而异。通常,染色盘中的液体作为危险废物丢弃在密封瓶中。将载玻片浸泡在 10% 的漂白剂溶液中,然后将其丢弃在锐器容器中。

提示

  • 请记住,革兰氏染色的产量仅与标本一样好。重要的是教会患者提供良好的样本(例如,痰样本的吐痰与深咳之间的区别)。
  • 作为脱色剂,乙醇的作用比丙酮慢。
  • 遵循标准的实验室预防措施。
  • 使用面颊拭子进行练习,因为样本应同时包含革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。如果您只看到一种或另一种类型,您可能使用的脱色剂太少或太多。
  • 您可以使用弹簧式木制衣夹夹住滑梯。

警告

  • 丙酮和乙醇易燃。丙酮会去除您手上的油脂,使您的皮肤更容易吸收其他化学物质。戴上手套并谨慎使用。
  • 在冲洗掉污渍或复染剂之前,不要让污渍变干。

受主题流行